노로바이러스 전장유전체 분석 및 식중독 바이러스 동시 검출법 개발

 
기타서명 Analysis of the Whole Genome Sequences of Norovirus and Development of Multiplex Realtime RT-PCR

              for Norovirus and Hepatitis A Virus
저자 이정수
형태사항 v, 92 p. : 삽화 ; 26 cm.
일반주기 충북대학교
              지도교수: 김영창
              참고문헌: p.82-92
학위논문사항 학위논문(박사)-- 충북대학교 일반대학원 : 합성생물학협동과정 합성생물학전공 2016. 2
KDC 511.55 5
발행국 충청북도
언어 한국어
출판년 2016
소장기관 충북대학교 도서관

 
초록
Norovirus (NoV) and Hepatitis A virus (HAV) are important pathogenic viruses that cause foodborne and waterborne gastroenteritis outbreaks. NoV and HAV are transmitted via the fecal-oral route. NoV is a highly infectious virus with the potential of causing severe gastroenteritis. In Korea, HAV was designated as a legal infectious disease in 2010.
 To analyze the genetic distribution of NoV, this study used the sample information of underground waters during January 2009 to September 2013 by the data of National Foodborne Pathogen Surveillance Network. This study analyzed the genome sequences of detected Norovirus to obtain the molecular epidemiological information. As a result of genetic prevalence of NoV in underground water, GI-1 (24%) accounted for the highest number of detected cases in the NoV GI, while GII.4 (60%) had the highest number of detected cases in the NoV GII.
 The first objective of this study was development of detection method for NoV GII.4 using Next-Generation Sequencing (NGS), and second objective was development of detection method for NoV and HAV using multiplex realtime Reverase-Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR).
 Whole genome sequencing using NGS is a powerful tool in research of NoV infection. Therefore, NGS can be used as techniques to detect and characterize NoV variants. The analyses of NoV epitope, RNA secondary structure, GII.4 variant and genome mapping using NGS were performed using the CLC work bench assembler and DNAstar. The result of analyses of similarity and capsid epitope was confirmed GII..4 Sydney strains by NGS data. An amino acid sequence of the epitopes of the capsid P2 domain was same amino acid in Sydney 2012/ AU/ Acc. # JX459908.
 The specific primer and probe sets for the detection of NoV and HAV using multiplex realtime RT-PCR were investigated and probe reporter dye and primer sequence were modified for multiplex realtime RT-PCR. The sensitivity of the realtime RT-PCR was estimated by endpoint detection of strandard RNA and their serial 10-fold dilutions. The detection limit of realtime RT-PCR was confirmed up to 1 copy, 10 copy and 50 copy, respectively. The multiplex PCR method was successfully developed in this study, which could rapid detect NoV and HAV in water, oysters, etc with high accuracy. Therefore, it will contribute to ensuring food safety through the use of this rapid detection method for inspecting food.

 
목차
Ⅰ. 서 론 1
1. 바이러스 주 특성 1
1-1. 노로바이러스 (Norovirus) 1
1-2. A형 간염바이러스 (Hepatitis A Virus) 4
2. 연구의 필요성 6
2-1. 노로바이러스 분포 분석 6
2-2. 노로바이러스 전장유전체 분석 6
2-3. 식중독 바이러스 검출법 7
II. 재료 및 방법 9
1. 실험재료 9
1-1. 노로바이러스 분포 및 전장유전체 9
1-2. 식중독 바이러스 동시검출법 11
1-2-1. 노로바이러스 11
1-2-2. A형 간염바이러스 11
2. 연구방법 12
2-1. 노로바이러스 분포분석 12
2-1-1. 지하수 농축액 12
2-1-2. 유전자 추출 12
2-1-3. 노로바이러스 유전자 증폭 14
2-1-4. 노로바이러스 유전자형 분석방법 15
2-2. 노로바이러스 전장유전체 분석 21
2-2-1. cDNA 합성 21
2-2-2. DNA 절편 증폭 24
2-2-3. NGS 분석 26
2-2-4. 노로바이러스 유전체 분석 27
2-3. 식중독 바이러스 동시검출법 32
2-3-1. 노로바이러스 분리동정 32
2-3-2. A형 간염바이러스 분리동정 32
2-3-3. 프라이머 및 프로브 33
2-3-4. Realtime RT-PCR 방법 최적화 37
2-3-5. Multiplex 노로바이러스 및 A형 간염바이러스 동시검출 37
2-3-6. 정량분석 37
2-3-7. 노로바이러스 GI, GII 동시검출 39
III. 결 과 41
1. 노로바이러스 분포분석 41
2. 노로바이러스 전장유전체 분석 46
2-1. 전장유전체 분석시료 유전자형 결정 46
2-2. cDNA 합성결과 46
2-3. DNA 절편 증폭 46
2-4. 노로바이러스 전장 유전체 분석 51
3. 식중독 바이러스 동시 검출법 61
3-1. 노로바이러스 및 A형 간염바이러스 분석시료 동정 61
3-2. 프라이머와 프로브 61
3-3. A형 간염바이러스 및 노로바이러스 동시검출 68
3-4. A형 간염바이러스 및 노로바이러스 동시검출 정량한계 68
3-5. 노로바이러스 GI, GII 동시검출 73
3-6. 노로바이러스 GI, GII 동시검출 특이성 73
IV. 고 찰 76
1. 노로바이러스 분포 분석 76
2. 노로바이러스 전장유전체 분석 77
3. 노로바이러스 및 A형간염바이러스 동시검출법 개발 78
V. 결 론 81
VI. 참고문헌 82