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생쥐 유도만능 줄기세포에서 재조합 단백질 Cre를 이용한 유전자 조작 / 정은정

18 인체실험 조회 수 366 추천 수 0 2017.01.13 10:04:11
nibp *.223.3.98
발행년 : 2011 
구분 : 학위논문 
학술지명 :  
관련링크 : http://www.riss.kr/link?id=T12322852 

생쥐 유도만능 줄기세포에서 재조합 단백질 Cre를 이용한 유전자 조작

= Gene Manipulation in Mouse Induced Pluripotent Stem Cells by Cre recombinant protein

                                        

  • 저자

    정은정                                       

  • 형태사항

    56p ; 26cm

  • 일반주기

    지도교수 :추영국

  • 학위논문사항

    학위논문(석사)-- 원광대학교 일반대학원 : 생물학과 2011. 2

  • 발행국

    전라북도

  • 언어

    한국어

  • 출판년

    2011

  • 초록 (Abstract)
    • 2006년 Shinya Yamanaka 교수는 4가지 전사인자 Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4를 레트로바이러스(retrovirus)를 통해 감염시켜 설치류 체세포를 역분화 (reprogramming) 하여 배아줄기세포 (Embryonic Stem Cells) 와 유사한 ...
    • 2006년 Shinya Yamanaka 교수는 4가지 전사인자 Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4를 레트로바이러스(retrovirus)를 통해 감염시켜 설치류 체세포를 역분화 (reprogramming) 하여 배아줄기세포 (Embryonic Stem Cells) 와 유사한 세포를 생성하고 뒤이어 2007년 렌티바이러스(lentivirus)를 이용한 유전자 조작을 통해 사람의 피부 세포를 이용하여서도 배아줄기세포와 유사한 세포를 생성하게 된다. 이 세포가 바로 유도만능줄기세포(induced Pluripotent Stem cells; iPS cells)로 배아줄기세포의 윤리적인 문제와 성체줄기세포(Adult Stem Cells)의 낮은 분화능력을 해결 할 수 있는 대안으로 여겨지고 있다.
      유도만능줄기세포를 생성하는 방법에는 바이러스를 이용한 방법 외에도 단일 플라스미드 벡터(single plasmid vector), 소분자 물질(small molecule), 재조합단백질(recombinant protein) 등이 있으나 세포 생성률이 바이러스를 이용한 방법보다 낮다는 단점을 가진다.
      하지만, 바이러스를 이용해 유도하는 방법은 체세포 안으로 들어간 역분화 인자(reprogramming factors)의 융합과 재활성으로 인해 암이 발생된다는 단점을 가지고 있다.
      최근 이러한 문제점을 해결하기 위해 일시적인 역분화 유도나 역분화 진행이 끝난 후 역분화 인자를 제거하는 논문들이 발표되고 있다.
      그 중에서도 2009년 Kaji et.al 는 Cre-loxP 시스템을 이용하여 역분화된 세포에서 역분화 인자들을 Nucleofection을 통해 제거하고 그 세포가 계속적으로 다분화능을 유지한다고 발표하였다.
      이들이 사용한 세포는 loxP 부분 사이에 역분화 인자와 mOrange를 가지고 있어 주황색을 나타내지만, loxP를 인지한 Cre에 의해 제거가 되면 주황색을 나타내지 않게 되는 특징을 가지고 있다. 이들은 Nulcleofection을 통해 Cre를 주입하여 주황색을 띄지 않는 세포를 확인하여 역분화 인자가 제거 된 것을 확인하였다.
      하지만, Kaji et.al이 사용한 방법은 세포에 손상을 입힐 것이라 생각되어 우리는 다른 Cre 재조합 단백질(recombinant protein)을 처리하여 역분화 인자를 제거하였다.
      우선 생쥐 유도만능 줄기 세포를 배양하고 계대 배양 할 때 8ug/ml의 Cre 재조합 단백질을 처리 하였다. 약 10일~11일 후 주황색을 띄지 않는 배아줄기세포와 닮은 세포를 확인하여 단백질을 이용한 방법으로도 역분화 인자가 제거된다는 것을 확인할 수 있었으며, 이 방법은 지금까지 소개된 다른 방법보다 간단하고 안정한 방법이라 할 수 있다.
      더 나아가 Cre 재조합 단백질을 이용한 Cre-loxP 시스템이 체세포에서도 적용 가능하다면 우리는 항생물질내성(Antibiotic resistance)을 가지지 않은 세포 주를 통해 이종장기이식(xenotransplataion)이나 바이오리액터(bioreactor)에 사용되는 동물 생산하고 적용할 때 안전성이 한층 더 강화 될 수 있을 것이라 생각된다.

      Key words: induced Pluripotent Stem Cells, Cre-loxP system


    • 목차 (Table of Contents)
    • I. Introduction 3
    • II. Materials and Methods 6
    • II-1. Cre 11R in pET-52b Plasmids construction 6
    • II-2. Construction of pGAL10-His6.ek.Cre 11R (6H.ek.Cre11R) expression vector 6
    • II-3. The Media and culture conditions are used for yeast transformation 7
    • II-4. The Yeast Strains and transformation of pGAL-His6.ek.Cre11R 7
    • II-5. Purification of recombinant Cre protein 8
    • II-6. SDS-PAGE analysis of Cre protein 9
    • II-7. Mouse induced Pluripotent Stem Cells (miPSCs) culture and Reprogramming cassette excision of miPSCs 10
    • II-8. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) analysis of reprogramming cassette excision of miPSCs 11
    • III. Results 12
    • III-1. Product of Cre 11R in Protein expression vector pET-52b (Cre11R-52b) 12
    • III-2. Construction for Pufication of Cre 11R Recombinant Protein from yeast 17
    • III-3. Comparison of Protein product from induced Cre recombinant protein from S.cerevisiae Y2805 ?gal1 and L3262 ?pmr1 20
    • III-4. Purification of assumed Cre recombinant Protein from L3262?pmr1 27
    • III-5. Culture of mouse induced Pluripotent Stem Cells (miPSCs) 29
    • III-6. Excision of Reprogramming factors in miPSCs by Cre 11R recombinant protein 31
    • IV. Discussion 35
    • V. References 38
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