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CRISPR/Cas9 시스템 기반 무당질항체 생산용 마우스 제작을 위한 마우스 유래 세포주 NIH-3T3 세포에서의 Ighg 유전자 교정 연구 / 이난이
15 유전학 조회 수 240 추천 수 0 2017.05.26 10:21:38| 발행년 : | 2017 |
|---|---|
| 구분 : | 학위논문 |
| 학술지명 : | |
| 관련링크 : | http://www.riss.kr/link?id=T14437431 |
- 기타서명
A study of Ighg gene correction in mouse-derived NIH-3T3 cells using CRISPR/Cas9 system to generate aglycosylated antibody-producing mice
- 저자
이난이
- 형태사항
v, 33 p. : 삽화 ; 26 cm.
- 일반주기
충북대학교 논문은 저작권에 의해 보호됩니다
지도교수: 하현정,김용삼
참고문헌 : p.29-32 - 학위논문사항
학위논문(석사)-- 충북대학교 일반대학원 : 생화학과 생화학 및 분자생물학전공 2017. 2
- KDC
476.10733 5
- 발행국
충청북도
- 언어
한국어
- 출판년
2017
- 초록 (Abstract)
- Many lines of study indicate the involvement of altered glycan structures in various diseases such as cancer, and the utilization of such altered glycoproteins is an aspect of crucial importance in precision medicine. The identification and quantitative measurement of protein glycans rely on the combinatorial use of an antibody and a glycoform-specific lectin, in which an antibody captures a target glycoprotein and a lectin recognizes the disease-specific glycan structures of the target protein. However, there exists a fundamental analytical problem in this assay modality in that a lectin often binds to the capture antibody independent of analyte proteins, and this problem results in a high blank value, thereby necessitating the generation of an aglycosylated antibody. A fundamental method to address this hurdle would be the generation of an glycosylated antibody-producing mouse line using CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 genome editing technology. A main type of antibody used for immunoassays is immunoglobulin G, and there exists a N-glycosylation site (Asn) in the CH2 region of mouse Ighg genes. A mouse line that is corrected at this Asn-coding sequence to non-Asn-conding one can be used to produce an aglycosylated antibody. To fulfill this aim, we attempted to establish efficient CRISPR/Cas9 genome-editing system including the selection of target sites for each Ighg allele and design of the corresponding single-guide RNAs (sgRNAs) and donor DNAs. Among the possible candidate targets, an sgRNA with a highest indel efficiency together with a donor DNA was selected, and the CRISPR/Cas9 module was applied to mouse-origin NIH-3T3 cells. Resultantly, we could establish a highly efficient gene knock-in system. It is expected that this highly efficient knock-in system can be directly applied to the genome engineering of an aglycosylated antibody-producing mouse.
- 목차 (Table of Contents)
- Ⅰ. 서 론 1
- 1. 바이오마커로서의 당단백질과 분석방법의 문제점 1
- 2. 유전자 편집과 CRISPR/Cas9 시스템 3
- 3. 연구의 목적 7
- Ⅱ. 실험 재료 및 방법 8
- 1. 세포 배양 8
- 2. Gene cloning 8
- (1) 마우스 유래 세포주의 Ighg 유전자 확인 8
- (2) Donor DNA 제작 9
- (3) Guide RNA 제작 10
- 3. Transfection 12
- 4. In vitro assay 12
- Ⅲ. 결 과 13
- 1. Wild type 마우스 Ighg subclass DNA 서열 확인 13
- 2. 마우스 유래 세포주 MEF와 NIH-3T3로의 CRISPR/Cas9 시스템 적용 15
- 3. sgRNA 제작 및 최적 sgRNA 선별 19
- 4. sgRNA 맞춤 donor 제작 22
- 5. NIH-3T3 세포주에서의 knock-in 24
- Ⅳ. 고 찰 26
- Ⅴ. 결 론 28
- Ⅵ. 참고문헌 29
- Ⅶ. 감사의 글 33
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