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글 수 4,668
| 발행년 : | 2014 |
|---|---|
| 구분 : | 학위논문 |
| 학술지명 : | |
| 관련링크 : | http://www.riss.kr/link?id=T13458308 |
유전자가위를 이용한 유전자 적중 Mouse 제작 기술의 개발
- 기타서명
Development of knockout mouse production technology by engineering nucleases
- 저자
전지선
- 형태사항
79장 : 삽화(일부천연색) ; 26 cm
- 일반주기
지도교수: 이한웅
- 학위논문사항
학위논문(석사)-- 연세대학교 대학원 : 생화학과 2014. 2
- 발행국
서울
- 언어
한국어
- 출판년
2014
초록 (Abstract)
- 유전자 가위를 이용한 유전자 적중 Mouse제작 기술의 개발 인류의 질병을 연구하는데 유전자 변형 생쥐모델을 이용하는 것은 매우 효과적인 방법이다. 하지만 ES cell에서 Homologous Recombination (HR)을 이용하는 그 방법은 생산효율이 낮고 비용이 많이 드는 단점이 있었다. 반면, 최근에 주목받고 있는 genome engineering 기술은 특정 염기서열을 인식하는 DNA binding motif와 endonuclease Fok1의 합성 단백질을 이용하여 짧은 시간에 높은 효율로 유전자 변형을 유발할 수 있다. Fok1은 genome을 무작위로 "Chew back" 하여 double strand breaks (DSBs) 를 일으킨다. 이 때 in vivo 상에서는 DNA repair system이 발동하여 HR 또는 NHEJ (non homologous end joining)에 의해 변형된 염기서열을 갖게 된다. 본 연구자는 여러 동물모델에서 TALEN을 이용해 유전자를 modify한 결과들을 바탕으로 이를 mouse에도 적용하기로 결정하였다. 따라서 Pibf1, Sepw1 유전자를 표적으로 하는 TALE과 Fok1 결합단백질을 합성하여 construct를 제작하였고, 이 중 NHEJ reporter assay를 통해 유전자 결손을 일으키기 충분한 것을 사용하였다. TALEN을 이용한 knockout rat을 제작한 이전의 연구를 토대로 mRNA를 합성하고 농도 조건을 달리하여, mutation이 발생하는 비율을 보았다. 그 결과 농도와 mutation 비율이 비례함을 확인하였다. Pibf1-TALEN과 Sepw1-TALEN founder mouse는 T7E1 mutagenesis assay를 토대로 screening 하였다. 고농도의 mRNA를 미세 주입한 embryo에서 Pibf1-TALEN는 76%, Sepw1-TALEN는 66%의 높은 mutation 비율을 나타냈다. 또한 두개의 allele이 모두 변형되는 bi-allelic mutant가 나타나 homozygous knockout mouse를 생산하지 않고도, 유전자 변형에 의한 표현형을 관찰 가능하다. 50 ng/㎕의 고농도의 mRNA를 미세 주입한 경우 생존율이 4.1%로 매우 낮아 표적 외 염기서열에 off target effect가 나타난 것이라 예상하였다. 하지만 상동관계가 높은 다른 염기서열에서 off target effect를 확인할 수 없었다. 또한 Mutant allele은 WT mouse와의 교배를 통해 다음 세대로 전달됨을 확인하였다. 하지만, Direct sequencing으로 mutant allele의 표적 염기서열부분을 확인한 결과 대부분이 2개의 mutant allele 혹은 heterozygous mutant allele이 나타났다. 따라서 TALEN이 one cell stage 내에 충분히 돌연변이를 유발할 수 있음을 알 수 있었다. 그렇지만 mutant mouse 중 3개 이상의 allele을 가진 founder가 확인되었다. 이는 sperm과 egg의 nucleus가 fusion 되기 전에 한 번의 DNA replication이 일어날 수 있어, TALEN이 early one cell stage부터 작용이 가능함을 확인하였다. . 마지막으로 제작한 Sepw1 mutant mouse가 유전자 결손으로 인해 원래의 기능을 수행하지 못하는지 확인하였다. Sepw1 bi-allelic mutant mouse에서 해당 단백질이 발현되지 않음을 확인하였다. 이로써 TALEN은 짧은 시간과 적은 비용으로 knockout mouse를 만들 수 있는 방법을 제시하였다.
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