크리스퍼 유전자 가위에 의한 비상동말단연결의 정확성 분석 

: Evaluating the accuracy of non-homologous end joining induced by a CRISPR-Cas9 system

• 저자 :  양소연
  
• 형태사항 : ; 26 cm
  
• 일반주기 : 지도교수: 배상수
  
• 학위논문사항 : Thesis(Master)-- 한양대학교 일반대학원 : 화학과 2017. 8
  
• 발행국 : 대한민국
  

• 초록
  

3세대 유전자 가위인 크리스퍼 유전자 가위는 유전체 내에 특정 염기 서열을 인식하여 이중나선절단(double strand break, DSB)을 유도할 수 있다. 이중나선절단은 세포 내에서 상동재조합 (homology directed repair, HDR)이나 비상동말단연결(non-homologous end joining)에 의해서 수선된다. 상동재조합은 상동 염기 서열의 주형 DNA가 존재하는 경우, 상동성 주형 DNA를 바탕으로 수선하기 때문에 비교적 정확하게 수선이 일어난다. 반면에 비상동말단연결은 절단된 끝이 바로 연결되기 때문에 부정확한 수선이 일어나며, 유전체 내에 삽입과 결실을 일으킨다. 비상동말단연결은 상동재조합에 비해 높은 빈도로 일어나며, 세포주기에 영향을 받지 않는다. 이러한 이유로 최근 비상동말단연결을 이용한 유전자 치료제 개발 연구에 이용되고 있다. 그러나 크리스퍼 유전자 가위에 의해 유도되는 비상동말단연결이 얼마나 정확하게 이루어지는지를 정량적으로 분석이 어려워 알려지지 않았다. 이 연구에서는 비상동말단연결의 정확성을 측정하기 위해 크리스퍼 유전자 가위를 이용하여 DSB을 유도였고, 이중결합 올리고데옥시뉴클레오타이드를 녹인 시켰다. 비상동말단연결의 정확성은 PAM 서열에서 가까운 쪽과 먼 쪽에서 측정되었으며, 그 값은 타겟마다 다양하게 나타났다. 정확성은 PAM 서열에서 가까운 쪽보다는 먼 쪽에서 더 높게 측정되었으며, 염색체의 위치보다는 염기서열에 영향을 받는 특징을 보였다. 이러한 결과는 크리스퍼 유전자 가위에 의한 비상동말단연결이 일어날 때의 작동 원리를 규명하는데 도움이 될 수 있다. 또한, 특정 염기 서열을 타겟하여 유전체 교정을 할 때 정교한 교정을 가능하게 하여 유전자 치료제에도 이용할 수 있을 것으로 전망된다

목차

bstract 3

List of Figures 5

List of Tables 6

List of Abbreviation 7

Introduction 8

Material and Methods

1. Production of sgRNA 10

2. Human cell culture and transfection 10

3. dsODN for NHEJ knock-in 11

4. Genomic DNA extraction and PCR amplifications 11

5. PCR purification and Illumina next-generation sequencing 12

6. Quantification of precise repair in NGS data 12

Results

1. Overview of evaluation of NHEJ Accuracy induced by a CRISPR-Cas9 system 25

2. Accuracy values of NHEJ repair in HeLa and HEK293T cell lines 29

3. Position dependence and sequence dependence of NHEJ repair 42

Discussion 46

Reference 48

Abstract in Korean 51.