Improved Transfection Efficiency and Metabolic Activity in Human Embryonic Stem Cell Using Non-Enzymatic Method

: 비효소적 방법을 사용한 인간배아줄기세포의 형질주입 효율 및 대사활성의 증진 연구

 
저자 황인규
형태사항 43 ; 26 cm
일반주기 지도교수: 정형민
학위논문사항 Thesis(M.A.)-- 건국대학교 대학원 : 의학과 2016. 8
발행국 대한민국
언어 영어
출판년 2016
소장기관 건국대학교 상허기념도서관

초록
인간배아줄기세포는 전분화능세포로써, 자기 재생능과 무제한 증식 및 다양한 세포로의 분화가 가능한 특징 때문에 중개의학 연구에 광범위하게 사용되고 있다. 유전적으로 조작된 인간배아줄기세포는 연구에 있어 중요한 가능성을 가지고 있지만, 낮은 형질주입 효율이라는 문제점 때문에 이러한 연구에 있어서 한계가 존재하고 있다. 낮은 형질주입 효율을 개선시키기 위해서, 본 연구에서는 Trypsin과 TrypLE, 그리고 EDTA를 사용하여 인간배아줄기세포로의 형질주입을 진행 및 효율과 형질주입 후 대사활성을 비교하였다. 녹색형광단백질 벡터를 이용한 유동 혈구 계산 분석을 통해 진행한 결과, EDTA를 이용한 방법이 일반적으로 사용되는 효소 방법과 비교하였을 때보다 형질주입에 있어서 높은 효율을 나타내었고, 그 외에도 EDTA를 활용한 방법은 형질주입 후 배아줄기세포의 세포 생존율과 세포의 수복에 있어 효소를 이용한 기존의 방법보다 안정된 결과를 확인하였다. 또한 세포 외 유동성 분석 장비를 통한 대사활성 측정을 진행한 결과, EDTA를 이용하여 형질주입을 진행한 군이 일반적인 세포군들과 유사한 세포대사 활성도를 나타내었고, 일반적으로 사용되는 효소 이용 형질주입 진행 군들에 비해 더 높은 세포대사 활성 결과를 확인하였다. 이러한 결과들은 형질주입 기술을 진행함에 있어, 기존에 사용되고 있는 효소처리 방법과 EDTA를 이용한 처리 방법과 비교하였을 때, EDTA처리 방법이 더 높은 효율을 가지고 또 형질주입에서 이를 대체할 수 있다는 결과를 보여준다. 이는 인간배아줄기세포의 기본 연구뿐만 아니라 줄기세포 중개의학 분야에도 유용한 연구가 될 것으로 판단된다.

 
목차
1. Introduction 1
2. Materials & Methods 4
2.1. hES cell maintenance 4
2.2. Embryoid body formation 6
2.3. hESC characterization 8
2.3.1. Immunocytochemistry 8
2.3.2. Karyotyping analysis 9
2.4. EB characterization 10
2.4.1. Immunocytochemistry 10
2.5. Transfection assay 11
2.5.1. Lipofection assay 11
2.5.2. Electroporation assay 12
2.6. Flow cytometry analysis 14
2.7. Cell viability & recovery rate 15
2.8. Extracellular flux assay 16
2.8.1. Oxygen consumption rate (OCR) 16
2.9. Statistical analysis 17
3. Results 18
3.1. hESC characterization 18
3.1.1. Immunocytochemistry 18
3.1.2. Karyotyping 20
3.2. EB characterization 22
3.2.1. Immunocytochemistry 22
3.3. Comparison of transfection efficiency using enzymatic and non-enzymatic reagents 24
3.3.1. Lipofection 24
3.3.2. Electroporation 26
3.4. Transfected cell viability and recovery rate 29
3.5. Extracellular flux assay 33
4. Discussion 35
5. References 38
6. Abstract (in Korean) 42

주제어
Human embryonic stem cell, Transfection, Viability, Metabolic activity, Cell dissociation