연속합성배양액들의 개발과 시험관아기프로그램에서 그들의 임상적용에 관한 연구

• 저자[authors] : 윤산현
• 발행사항 : 서울 : 고려대학교 대학원, 2005
• 형태사항[Description] : xxv, 232 p. ; 26cm
• 학위논문사항[Dissertation] : 학위논문(박사)-- 고려대학교 대학원 : 응용동물과학과 동물육종및번식학전공 2005. 8
• 발행국(발행지)[Country] : 서울
• 출판년[Publication Year] : 2005
• 소장기관[Holding] : 고려대학교 도서관 (211009)

초록[abstracts]

사람의 체외수정과 배아이식(시험관아기)프로그램은 불임을 빨리 극복할 수 있는 진보적 방법이다. 체외수정 및 배아 연구실은 시험관아기 프로그램의 성공율을 이끄는 데에 결정적인 역할을 하고 있다. 시험관아기 프로그램에서 가장 중요한 하나의 요인은 사용된 배양액의 조성과 그 질이다.  배양액 및 배양환경이 양호하더라도 그 조성분과 각각의 농도를 모른다면 배양조건을 높은 수준으로 매일 유지한다는 것은 매우 어렵다.  본 연구는 1) 시험관아기프로그램의 전통적인 배양체계안에서 체외수정과 수정란의 배양에 가장 적합한 배양액, 천연첨가제 및 공배양세포들을 조사하고, 2) 그러한 조건들을 토대로 하여 난자와 배아의 발생단계에 적합한 연속합성배양액들(sequential synthetic culture media, SSCM)을 개발하고, 3) 임상적용을 통하여 새로 개발한 연속합성배양액들의 효율성을 전통적인 배양체계와 비교하고자 하였다.     전통적으로 배양액은 수정용 배양액, 초기배아성장용 배양액 및 후기 배아성장용 배양액으로 구분하고 있다. 그러한 배양액들은 첨가제로서 환자의 혈청, 사람의 제대혈청(human fetal cord serum, HFCS) 혹은 사람의  혈청알부민용액(human serum albumin, HSA)을 사용하여 왔다. 시험관아기 시술의 성공율을 높이기 위하여 때때로 난관상피세포 (human oviduct epithelial cells, HOECs)나 난구세포(human cumulus cells, HCCs)와 같은 사람의 체세포와도 공배양하여 왔다. 혈청을 배양액에 첨가하는 것은 세균의 오염 가능성 및 불순물의 혼입을 초래하였다. 또한, 공배양세포들은 여러 가지 성장요인들(growth factors)을 배양액에 분비하여 배아의 발생, 즉 영양배엽 (trophectoderm) 및 내세포괴(innercell mass, ICM)의 발생을 자극하여 왔지만, 공배양체계를 확립하려 할때 하나의 배양체계내에 삼위일체(배아, 배양액 및 공배 양세포)의 조건을 충족시켜야 하며 그로 인하여 불순물의 유입이 가중되어 왔다. 그러므로, 최근의 배양체계는 공배양체계에서 세포나 혈청을 배제한 연속배양체계로 바뀌어 가고 있다. 그러나 배양액들은 분명하게 배양용도에 따라서 한정되고 있으나 단백질첨가제 용액을 사용하므로서 또 다시 한정되지 않은 배양조건이 되고 있는 실정이다.      본 연구에서 사람의 착상전 배아의 발생단계를 수정단계, 초기 발생단계, 상실배발생단계 및 후기배발생단계로 구분하고, 각각의 발생단계에 적합한 연속합성배양액들(SSCM)을 고안하였다. 하나의 합성난자완충액(synthetic buffer for ova, SBO)과 네 가지의 합성첨가제용액들(synthetic additive solutions, SASs)을 고안하여 합성난자완충액에 각각의 합성첨가제용액을 일정한 비율로 혼합하므로서 그 결과물들이 성공적인 시험관아기프로그램에 이용 되도록 하였다. 합성난자완충액이 기본적인 기질들, 아미노산들, 비타민들의 공급 및 적절한 삼투압과 수소이온농도를 유지할 수 있도록 고안하였으며, 합성첨가제용액들이 각각의 발생단계에 생리적으로 적합한 영양적인 요구를 충족시킬 수 있도록 고안하였다. 합성첨가제용액들을 합성수정용 첨가제(synthetic additive for fertilization, SAF01), 합성초기성장용첨가제 (synthetic additive for early growth, SAG13), 합성상실배성장용첨가제(synthetic additive for morula growth, SAG34) 및 합성후기성장용첨가제(synthetic additive for late growth, SAG46)로 구분하였다. 합성난자완충액에 15% (v/v)의 수준 으로 각각의 합성첨가제용액을 첨가하였을 때, 결과적으로 합성수정배양액 (synthetic insemination medium, SIM01), 합성초기성장배양액(synthetic early growth medium, SEGM13), 합성상실배성장배양액(synthetic morula growth medium, SMGM34) 및 합성후기성장배양액(synthetic late growth medium, SLGM46)이 되었다. 연속합성배양액들은 전통적인 배양체계에서 가장 적합한 배양조건(제 3장)과 이전의 많은 연구에 근거한 배양액들의 조성분 들을 가지고 고안하였다.  기초배양액으로서 수정된 Ham’s F-10 (mF-10)을 이용해서 단백질첨가제 로서 난포액(human follicular fluid, HFF)과 제대혈청을 비교하였던 바, 이용성과 적합성에 있어서 난포액이 제대혈청보다 우위에 있었다. 난포액을 첨가한 mF-10을 이용하여 공배양세포로서 난관상피세포와 난구세포를 비교하였던 바, 이용성 및 효율성에 있어서 난구세포가 난관상피세포보다 우위에 있었다. 그러나, mF-10은 난포액을 첨가하고 난구세포들과 공배양 할지라도 잉여배아의 포배기배아형성율(blastocyst formation rate)을 개선하지 못 하였다. 그러므로 미성숙난자의 체외성숙과 수정을 통하여 얻어진 소의 수정란을 이용하여 포배기배아(이하 “포배”)발생율을 mF-10과 CR1aa보다 유의하게(P < 0.05) 개선할 수 있는 배양액 YS1을 제조하였다. 더욱이 난포액의 피루빈산(pyruvate)과 유산(lactate)을 분석하여 배양액을 재구성 하므로서 배양액 YS2를 제조하였다. 사람의 배아를 난구세포들(N = 2.5 x 103)과 함께 15%(v/v)의 난포액을 첨가한 20 &#61549;l의 배양액에서 배양하였을 때, YS2는 mF-10보다 유의하게(P < 0.001) 높은 포배발생율을 나타냈다 (제 3장). 한편, 15%(v/v)의 난포액을 첨가한 20 &#61549;l YS2에서 난구세포들(N = 2.5 x 103)과 함께 배양하는 배양체계(이하 “YS2-coculture”)는 상용화되고 세계적으로 널리 사용하여온 연속배양액 G1.2/G2.2와 0.5%(w/v)의 HSA용액을 이용한 배양체계(이하 “G1.2/G2.2-culture”)와 유사한 포배발생율을 나타냈으며, 시험관아기프로그램에서 임상결과는 YS2-coculture가 G1.2/G2.2-culture보다 높은 경향을 나타냈다(제 3장).     사람의 난모세포가 포배로 성장하는데 필요한 배양액을 재구성하기 위하여 난포액이 함유하고 있는 필수/비필수아미노산들, 알부민, 글로블린들, 호르몬들 및 성장요인들을 분석하였다(제4장). 상용화된 MEM(Eagle, 1959)과 RPMI1640 (Moor 등, 1967)의 아미노산용액들에 비하여 난포액에서 발견된 알라닌(L-alanine)과 글라이신(L-glycine)의 농도는 유의하게 높았으며 아스파틱산(L-aspartic acid)은 유의하게 낮았다. 특히, RPMI1640이나 MEM의 필수아미노산들의 양은 난포액의 4~5배로 유의하게 많았다. 난포액에서 알부민, &#61537;1-글로블린, &#61537;2-글로블린 및 &#61538;-글로블린의 농도(g/dL)는 각각 4.56 ± 0.17, 0.37 ± 0.02, 0.43 ± 0.01 및 0.87 ± 0.09로 나타났다. 난포액에서 난포자극호르몬(FSH), 황체호르몬(LH) 및 인슐린의 농도(mIU/dL)는 각각 524 ± 23, 76 ± 12 및 0.3 ± 0.1로 나타났다. 또한, IGF-I 와 IGF-II 의 농도(ng/dL)는 각각 10570 ± 660과 278 ± 23.9로 나타났다. 난포액과 YS2의 조성분을 근거로하여 합성난자완충액과 합성수정용첨가제, 합성초기성장용 첨가제, 합성상실배성장용첨가제 및 합성후기성장용첨가제를 고안하였다. 또한 합성비필수아미노산용액(synthetic nonessential amino acid solution, SNEaaS)과 합성필수아미노산용액(synthetic nonessential amino acid solution, SEaaS)을 고안하고 이들을 합성난자완충액과 모든 합성첨가제용액들의 조성분이 되도록 하였다. 시험관아기프로그램에서 연속합성배양액들의 적용은 YS2-coculture에 비하여 초기배아의 발생은 물론 포배형성율과 영양배엽 및 내세포괴의 발생을 유의하게 향상시켰다(제 4장).     배양액들의 진정한 적합성실험은 배양했던 배아를 자궁에 이식해서 태아가 발생하는 것을 관찰하는 것이다. IVF-ET와 IVM/F-ET프로그램에서 새로이 개발한 연속합성배양액들을 이용한 배양체계와 제 3장 에서 가장 효율이 높았던 YS2-coculture를 임상적 결과를 통하여 비교하였다(제 5장). 분열배아들은 3일째 혹은 4일째에 각각 이식하였고 포배들은 5일째 혹은 6일째에 각각 이식하였다. 새로이 개발한 연속합성배양액들을 이용하였을 때의 착상율(implantation rate)과 임신율(ongoing pregnancy rate)들은 15%(v/v)의  난포액을 첨가한 20 &#61549;l YS2에서 난구세포 (N = 2.5 x 103)와 공배양하였던 YS2-coculture의 착상율과 임신율들에 필적하였다. 또한, 연속합성배양액들과 YS2-coculture에서 각각 생산된 포배의 동결과 융해 및 이식(thawing-ET)프로그램에서도 임신율은 연속합성배양액들의 적용에서 YS2-coculture와 통계적으로 차이가 나타나지 않았다. 오히려 이 프로그램에서 착상율은 연속합성배양액들의 적용이 YS2-coculture보다 유의하게 높았다(P < 0.01). 이는 YS2-coculture에 비하여 연속합성배양액들을 적용한 배양체계에서 더 건강한 포배들을 생산하고 있음을 시사한다. 종합적으로 여러 가지 시험관아기시술의 임상적 결과들은 발생단계별로 연속합성배양액들을 적용하는 배양체계가 생물학적 첨가제들(난포액 및 난구세포유래물질)을 포함하고 있는 전통적인 YS2-coculture와 비슷하거나 보다 높은 효과를 제공하고 있음을 시사하였다(제 5장).      결론적으로 시험관아기프로그램에서 사용할 수 있는 새로운 배양 체계는 두 가지 측면에 역점을 두어 확립하였다. 하나는 난자의 단계에서 포배기까지 배양의 전 과정에 기본적으로 사용이 가능한 합성난자완충액이며, 다른 하나는 수정 및 배아의 발생과정에서 필요한 영양적 요구들을 각각 충족시켜 줄 수 있는 합성첨가제용액들이다. 합성수정용첨가제, 합성초기성장용첨가제, 합성상실배성장용첨가제 및 후기성장용첨가제를 각각 15%(v/v)의 수준으로 합성난자완충액에 첨가하면 차례로 합성수정배양액, 합성초기성장배양액, 합성상실배성장배양액 및 합성후기성장배양액이 준비된다. 상용화된 배양액이나 연속배양액들은 알부민용액이나 합성혈청대체용액(SSS)을 첨가하므로서 난자나 배아의 영양적 요구를 충족 시킨다고 하나, 그 성분들과 농도들을 파악하기가 어려우며 비용면에서도 그 이용효율이 저조하다. 그러나, 새로이 개발된 본 연구의 결과물들(합성비필수아미노산용액, 합성필수아미노산용액, 합성 수정용첨가제, 합성초기성장용첨가제, 합성상실배성장용첨가제, 합성후기 성장용첨가제 및 합성난자완충액)은 모두 그 조성이 화학적으로 구체화되어 있으며 배양하기 직전에 합성난자완충액에 난자나 배아가 발생하는 단계별로 필요한 합성첨가제용액들을 각각 첨가하여 필요한 양의 연속합성 배양액들을 쉽게 제조할 수 있어 그 이용이 간편하고 또한, 발생단계별 추후연구의 기초가 될 수 있다.      향후의 연구에서는 난구세포로부터 유래되는 난자나 배아의 성장 요인들(embryotrophic factors)과 생리활성물질들(cytokines)을 검측하여 합성 첨가제용액들을 보완하여야 할 것이며, 더 나아가서는 배아가 발생하는 단계별로 난관액(oviductal fluid)이나 자궁액(uterine fluid)에서 유래하는 난자나 배아들의 성장요인들과 생리활성물질들을 검측하여 합성첨가제 용액들을 보완하여 그 효율을 높여야 할 것으로 사료된다.