포유동물 초기배아의 체외성숙과 체외발달 및 이종간의 체외수정에 대한 연구 

= In Vitro Maturation and Development or Interspecies Specific Fertilization in Mammalian Pre-implantation Embryos

http://www.riss.kr/link?id=T11927998

• 저자[authors] 김영훈
  
• 발행사항 청주 : 충북대학교, 2010
  
• 형태사항[Description] xvi, 143 p. : 삽도 ; 26 cm.
  
• 학위논문사항[Dissertation] 학위논문(박사)-- 충북대학교 대학원 : 축산학과 가축번식학전공 2010. 2
  
• KDC[Korean Decimal Classification] 527.34 5
  
• 발행국(발행지)[Country] 충청북도
  
• 출판년[Publication Year] 2010
  
• 소장기관[Holding] 충북대학교 도서관 (243009)
  

초록[abstracts] 

난자의 체외성숙, 체외수정, 단위발생 및 초기 배아의 체외배양은 생물의학과 발생공학의 응용에서 중요한 기술이며 체외성숙은 양질의 성숙된 난자를 제공하는 기반기술로 중요한 의의를 갖고 있다.      2장: 본 연구는 개과동물의 염색질, 세포소관 및 미세섬유의 변화를 관찰하였다. 개과동물의 배포(난핵포)는 염색질의 분열상태 및 응축상태에 따라 4개 단계로 나누어 분류 하였다. 발정기의 난소에서 채취한 난자는 GV-III 혹은 GV-IV 단계의 난자가 많고 비발정기의 난소에서 채취한 난자는 GV-I 혹은GV-II단계의 난자가 많다. 대부분의 (86.7%) 체내에서 배란된 난자는 GV-IV단계에 머물러 있다. 체외성숙 시켰을 때GVBD/MI/MII단계에 도달한 비율을 난포기 난소에서 채취한 난자가 비난포기 난소에서 채취한 난자보다 월등히 높았다. 염색체 면역염색실험을 통하여 GV단계에서의 미세소관은 난자의 대부분 세포질 내에 분포 되여 있으며 GV단계에서의 핵막의 붕괴시 미세소관 극은 응축하는 염색질주면에 분포 되여 있다. 이러한 극의 형성은 연장 되여 응축된 염색질 주변에서 관찰되었다. 난자내부 미세섬유는 피질에 있으며 GV염색질의 주변에 존재하며 성숙기에 많이 존재한다고 관찰 되였다. 본연구의 결과는 난포기 난소의 난자는 GV단계에서의 후기단계에 있으며 비발정기 난소의 난자보다 더 완벽한 성숙능력을 가지고 있다. 미세소관과 미세섬유는 개과동물 난자의 염색질의 재조합 및 감수분열에 모두 관여 한다는 것을 제시하였다.      3장: 본 연구는 우리가 처음으로 호르몬 처리한 고양이 난소의 난자에서의 미세소관 및 미세섬유에 대하여 관찰하였다. 또한 난자내부 방추사 및 미세섬유의 집결, MAPK의 활성화를 체외성숙시간이 변화에 따라 관찰하였다 (0, 6, 12 및 18 시간 체외성숙). 다음 체외성숙난을 처녀생식 후 전핵형성과 분할에 대하여 관찰하였다. 고양이 난자의 미세소관은 다른 종류와 같이 GV단계에 존재하였으며  GV breakdown 이후에 미세소관이 응축 되여 염색질 주위에 나타나며 감수분열 중기에는 방추사를 형성하였다. 고양이 난자내의 미세섬유는 GV단계에서 피질에 존재하며, 난자의 감수분열기간 염색질에 많이 분포 되여 있다. 고양이난자의 체외성숙율은 성숙시간의 증가에 따라 증가되지만 노화된 비정상적인 난자수도 증가된다. 또한 정상적인 난자의 미소섬유부분이 노화되지 않은 난자보다 두툼하다. 이러한 원인은 단위발생 후 두 개 핵에 한개 극체 형성율의 증가를 암시한다. Western blot 결과는 MAPK활성이 성숙시간의 증가에 따라 가속화됨을 관찰하였다. 결론적으로 호르몬 처리를 한 고양이 난자의 체외성숙시간의 제일 최적 시기는  12시간이내로 사료된다.     4장: 렙틴은 다공능성호르몬으로서 포유동물의 난자, 난포액 및 난구세포에 존재한다. 난자의 체외배양에 렙틴호르몬이 초기배아의 발달을 증가시킨다고 이미 보도 되였다. 그러나 렙틴호르몬이 난자의 세포질성숙 및 수정과정에 대한 영향은 명확히 밝혀진바 없다. 렙틴호르몬의 난자성숙에서의 작용을 진일보 밝혀내기 위하여 본 연구는 렙틴호르몬을 난자 체외성숙배양액에 처리하였을 때, 미세소관 및 미세섬유의 체외성숙단계 및 배반포 단계에서의 형성, 단위발생난 및 단정자주입술로 생산한 난자에서의 MAPK활성화 및 전핵 형성율에 대한 영향을 연구하였다. 10 혹은100 ng/ml 렙틴호르몬을 난자체외성숙배양액에 첨가 하였을 때 체외성숙율에는 큰 영향을 미치지 않았지만 단위발생난의 배반포형성율 및 배반포내의 세포수를 증가시켰다. 그러나 배반포에서의 세포사멸수에는 큰영향이 없었다. 돼지난자의 체외성숙 기간내에 렙틴 호르몬는 정상적인 방추사형성을 증가시켰다. 렙틴호르몬 처리군의 돼지난자 단위발생 난 혹은 정자미세주입에 의해 생산된 수정난의 MAPK활성화를 억제시켰으며, 전핵형성도 빠르게 진행시켰다. 본 결과는 렙틴호르몬은 수정후 난자의 체외성숙 및 전핵형성의 증가는 아마도 MAPK 작용경로를 하여 진행되는 것 같다고 생각된다.  5장: 이종간의 단정자수입법은 수정에 필요한 난자의 환경 및 정자의 구성요소에 대하여 연구에 중요한 기술이다. 고양이 난자와 정자의 수정에는 부계의 중심소립 구성요소로부터 유래한 sperm aster 필요하지만 생쥐 및 햄스터의 수정에는 모계의 중심소립의 구성으로 진행된다. 본 연구는 모계의 중심소립에 유래하는 sperm aster(생쥐 및 햄스터)가 부계의 중심소립에 의존하는 고양이 난자와 결합하였을 때 변화를 연구하려는 것 이다. 고양이 난자와 생쥐, 햄스터의 정자가 결합 6시간 후 웅성전핵과 자성전핵형성 과정은 모두 비슷하면 차이점이 없으며 고양이, 생쥐 및 햄스터 모두 sperm aster가 형성 되였다. 면역염색법으로 histone H3-m2K9항체로 염색체 염색을 진행한 결과 생쥐의 정자 염색질은 고양이 난자 염색질과 융합되며 metaphase을 형성하였으며 정상적으로 제2세포기 단계로 진화하였다. 본 결과들은 sperm aster 형성은 모계에 연관되며 고양이의 난자는 수정과정과 분열은 다른 동물과 특이적인 것이 아니라는 것을 증명 한다.

목차[Table of content] 

ChapterⅠ. Literature Review 1

 1. Overview of follicle and oocyte development in vivo 1

   1) Mammalian folliculogenesis. 1

   2) Mammalian oogenesis 4

 2. Mammalian oocyte maturation 6

   1) Mammalian oocyte nuclear maturation 8

   2) Mammalian oocyte cytoplasmic maturation 9

 3. Preimplantation embryonic development 10

   1) Mammalian oocyte fertilization 11

   2) Mammalian embryonic genome activation 12

   3) Mammalian preimplantation embryos cleavage 13

   4) Mammalian preimplantation embryos compaction 14

   5) Mammalian preimplantation embryos blastocyst formation 15

4. In vitro production (IVP) systems 16

   1) In vitro maturation 17

   2) In vitro fertilizationn 19

   3) Intracytoplasmic sperm injection (ICSI) 19

   4) Mammalian embryos parthenogenesis 20

5.  References 22

Chapter Ⅱ. Chromatin, Microtubule and Microfilament Configurations in the Canine Oocyte 31

 1. Abstract 31

 2. Introduction 32

 3. Materials and methods 35

   3.1. In vitro collection of canine ovaries and oocytes 35

   3.2. In vivo detection of estrus and collection of oocytes 36

   3.3. Immunofluorescence microscopy 37

   3.4. Statistical analysis 38

 4. Results 38

   4.1. Chromatin, microtubules and microfilaments in GV oocytes 38

   4.2. Microtubule organization during meiotic maturation 39

   4.3. Microfilament organization during meiotic maturation 40

5.  Discussion 45

6.  References 49

Chapter Ⅲ. Alterations of Spindle and Microfilament Assembly in Aged Cat Oocytes 58

 1. Abstract 58

 2. Introduction 59

 3. Materials and methods 62

   3.1. In vitro cat oocyte maturation and parthenogenetic activation 62

   3.2. Immunofluorescence staining 64

   3.3. Western blot analysis 64

   3.4. Experimental design 65

   3.5. Statistical analysis 67

 4. Results 67

   4.1. Cytoskeletal dynamics during meiotic maturation 67

   4.2. Effect of culture time on cat oocytes maturation rate, microtubule and microfilament assembly and MAP kinase activity 68

4.3. Effect of culture time on pronuclear formation and first cleavage of cat embryos 70

5.  Discussion 76

6.  References 79

Chapter Ⅳ. Leptin Accelerates Pronuclear Formation Following Intracytoplasmic Sperm Injection of Porcine oocytes: Possible Role for MAP Kinase Inactivation 85

 1. Abstract 85

 2. Introduction 86

 3. Materials and methods 89

   3.1. Chemicals and media preparation 89

   3.2. Oocyte collection and in vitro maturation 90

   3.3. Parthenogenic activation and embryo culture 90

   3.4. Injection of spermatozoa into oocytes 91

   3.5. Assessment of male and female pronuclear formation 92

   3.6. Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling (TUNEL) assay 92

   3.7. Immunofluorescence staining 93

   3.8. Western blot analysis 94

   3.9. Experimental design 95

   3.10. Statistical analysis 96

 4. Results 97

 4.1 Effect of leptin on oocyte maturation and embryo development 97

   4.2. Effect of leptin on microtubule and microfilament assembly 98

   4.3. Effect of leptin on pronuclear formation 98

4.4. Effect of leptin on mitogen-activated protein kinase    inactivation  99

5.  Discussion 108

6.  References 112

Chapter Ⅴ. Cat Oocytes Fertilization by Mouse Sperm Injection 117

 1. Abstract 117

 2. Introduction 118

 3. Materials and methods 120

   3.1. Generation of oocytes 120

   3.2. Preparation of spermatozoa 120

   3.3. Intracytoplasmic sperm injection (ICSI) 121

   3.4. Activation 122

   3.5. Analysis of DNA synthesis 122

   3.6. Anti-bodies 123

   3.7. Immunofluorescence staining 123

   3.8. Statistical analysis 123

4.  Results 124

5.  Discussion 132

6.  References 134

Chapter VI. General Summary 138