미생물 유전체 염기서열 분석과 약제내성 기작 연구를 위한 유전정보의 활용

 
 
기타서명 The Complete Microbial Genome Sequencing and Application of Genetic Information for Mechanisms

               of Antibiotic Resistance
저자 차선호
형태사항 iv, 72 p. ; 26cm
일반주기 인하대학교
              지도교수:박창신
              참고문헌 : p.57-60
학위논문사항 학위논문(박사)-- 인하대학교 대학원 : 의학과 2010. 2
DDC QU470 21
발행국 인천
언어 한국어
출판년 2010
소장기관 인하대학교 도서관

 
초록
국내에서 분리된 병원성 미생물 2종(NG, AB)의 유전체 염기서열을 분석하는 방법을 설명하였다. 특히 데이터의 품질을 향상시키는 finishing을 상황별로 세부적으로 기술하였으며 이는 다양한 종류의 유전체 염기서열 분석에서 발생 가능한 문제에 대해 실질적인 참고 자료로 활용될 수 있을 것이다. 또한 완전하게 분석된 유전체 염기서열은 생물정보학적 기법을 통해 유전자를 예측하고 해석하였고 병인과 관련된 주요 유전자의 구조적 특징을 분석함으로써 균주에 대한 유용 정보를 제공할 수 있게 되었다. 특히 NG는 분석된 유전정보를 활용하여 약제내성 연구 및 진단을 위한 DNA chip을 개발하고자 하였다.
미생물 전장 염기서열 분석은 ‘draft sequencing phase’와 ‘finishing phase’로 구분되는 ‘whole genome shotgun sequencing’ 방법을 각 미생물의 유전체 특성에 따라서 다소 변형하여 적용하였다. 대량의 염기서열을 생산하는 ‘draft sequencing phase’에서 NG는 대장균을 이용한 ‘in vivo shotgun clone library’를 제조하였고 AB는 oil-emulsion PCR을 이용한 ‘in vitro shotgun clone library’를 제조하였다. 제조된 클론은 sanger sequencing 또는 454 sequencing으로 염기서열을 분석하여 NG는 17,650개 그리고 AB는 862,301개의 shotgun reads를 각각 생산하였으며 이들을 어셈블하여 585개 그리고 219개의 염기서열 조각, 즉 ‘contig'를 생성할 수 있었다. Contig의 길이는 수백 bp에서 수백만 bp로 다양하였고 이들 간의 연결정보를 찾고 contig간의 ‘gap'을 closing 하는 ‘finishing phase’에서는 clone이나 PCR 또는 기존에 알려진 동종의 유전체 정보와의 비교를 통해 contig 간의 새로운 연결정보를 확인한 후 염기서열을 분석하였다. 또한 반복서열로 인한 어셈블 오류를 해결하기 위해 fosmid clone을 선별하여 shotgun sequencing으로 별도 분석 후 어셈블에 참여 시키는 방법을 추가 하였다. 구조적으로 분석이 까다로운 부위는 DMSO나 betain 등 반응 첨가물과 dGTP를 포함한 PCR 산물을 제작하여 염기서열을 분석하였다.
최종 분석 완료된 NG의 유전체는 2,674개의 유전자가 예측된 2,232,025bp 크로모좀 1개와 12개 유전자가 예측된 4,152bp 플라스미드 1개로 구성되고 54개의 tRNA, 4개의 rRNA cluster를 갖고 있다. AB는 3,715개의 유전자가 예측된 3,940,614bp 크로모좀 1개와 101개, 8개의 유전자가 각각 예측된 74,451bp, 8,041bp 플라스미드 2종으로 구성되고 71개의 tRNA, 6개의 rRNA cluster를 갖고 있다.
NG는 주변 환경에 적응 및 생존을 위해 매우 중요한 메커니즘으로 알려진 Type IV secretion system(TFSS)을 갖고 있었으며 또한 약재 내성 획득, 항원 다양성 및 숙주 면역반응 조절 등과 연관된 DNA uptake sequence, IS element, prophage, correia elements, transposases 등 다양한 종류의 반복서열이 확인되었다.
NG는 유전체 분석결과와 더불어 기존에 알려진 유전정보를 비교 분석함으로써 내성과 관련된 GryA 등 11종의 유전자에 대한 SNP 분석용 DNA 칩을 제작하였다. 이는 국내에서 분리된 NG 균들의 내성 관련 SNP를 쉽게 분석함으로써 병원균의 약재 내성기작을 연구하기위한 수단으로 사용하고자 하였다.

 
목차
서론 1
1. 미생물 유전체 전장 염기서열 분석의 필요성 1
2. 국내외 연구 동향 2
3. 유전체 전장 염기서열 분석기술의 발전 3
4. 유전체 전장 염기서열 분석방법과 Finishing의 필요성 3
5. 미생물 유전체 전장 염기서열의 활용 4
재료 및 방법 5
1. 재료 5
2. 방법 5
(1) Draft Sequencing 5
(2) Finishing 8
(3) Annotation 10
(4) NG DNA chip 개발 10
결과 및 고찰 11
1. Shotgun clone & Fosmid clone library 염기서열 분석 11
2. Draft Sequence의 Assembly 14
3. Finishing 19
(1) Low quality regions in contig 19
(2) Spanned(captured) gap closing 20
(3) Unspanned(uncaptured) gap closing 21
(4) Hard stop 및 homopolymers 해결 22
(5) Repeated sequence 분석 23
(6) NG Finishing 25
(7) AB Finishing 33
4. 최종 assemble 상태 확인 35
5. Fosmid library assemble 정보 활용 37
6. Primary Annotation 38
7. RNA 분석 40
8. Repeats Analysis 43
(1) Repeat 정의 및 분석 43
(2) Repeat coverage 44
(3) Repeat Type 분류 45
9. Comparative genome analysis 46
(1) Plasmid 비교 분석 50
(2) Gonococcal genetic island (GGI) 분석 51
10. 약제 내성 연구용 NG chip 개발 검토 52
(1) 약제 내성 및 virulence 유전자 비교 52
(2) 약제 내성 유전자 SNP 분석용 DNA chip 제작 54
결론 55
Reference 57
첨부 1. Fosmid clone positions in NG genome 61