Bipotential hemoangiogenic-like cells derived from human embryonic stem cells for hemangioblast and endothelial cell differentiation

: 인간 배아줄기세포 유래의 혈액모세포 및 기능성 혈관세포 분화 방법과 특성 연구

 
저자 길창현
형태사항 81 ; 26 cm
일반주기 지도교수: 정형민
학위논문사항 Thesis(doctoral)-- 건국대학교 대학원 : 의학과 줄기세포 중개의학 2016. 2
발행국 대한민국
언어 영어
출판년 2016
소장기관 건국대학교 상허기념도서관

 
초록
인간 혈액모세포는 혈액계통 및 혈관으로 분화가 가능한 다분화성 세포로 연구가치가 크지만, 인간 발달 초기에 발생하기 때문에 연구에 한계가 있다. 이러한 한계를 극복하기 위하여, 혈액모세포 연구에 분열과 증식이 무한한 인간 배아줄기세포를 활용하였다. 그러나, 기존 보고 된 방법들은 세포주에 의존적이고 인간 배아줄기세포 군집을 단일세포로 분리하는 과정에서 효소 및 레이저를 이용한 세포분리에 의한 세포 손상 및 사멸이 야기되어, 혈액모세포 및 혈관세포의 분화 유도 및 효율이 감소하는 문제가 있다. 이러한 문제점들 극복하기 위해서 재현성이 높은 단순한 분화 방법이 요구된다.
본 연구는 미분화 인간 배아줄기세포의 단일세포 분리과정에서 기존의 효소를 이용하지 않고, DPBS 방법을 도입하였다. 인간 배아줄기세포에 효소 처리한 그룹과 비교한 결과 세포의 생존이 증가함을 확인하였다. 효소를 사용하지 않는 방법에 의해 획득한 인간 배아줄기세포의 단일세포를 혈액모세포와 혈관세포로 분화가 가능한 배상체를 유도함과 동시에, 부유배양과 부착배양을 통해 이중분화를 유도하였다. 이후, 분화된 인간 배아줄기세포 유래 혈액모세포와 혈관세포 특성분석을 위하여 조혈계통 세포로의 분화와 유전자, 단백질 특이 인자 발현을 분석하였고, 분화 세포의 기능성을 검증하고자 하지허혈 동물모델에 인간 배아줄기세포 유래 혈관세포를 이식을 하였다. 그 결과, 하지허혈 모델에서 혈류 흐름이 개선되었음을 확인하였다. 치료능을 검증하기 위하여 컴퓨터 단층촬영과 조직분석을 통한 신생혈관 탐색을 통하여 치료능을 검증하였다.
본 연구는 인간 배아줄기세포의 분화과정에 생기는 문제점을 극복하고자 효소를 처리하지 않는 방법을 도입하였고, 분리된 인간 배아줄기세포의 단일세포로부터 혈액모세포와 혈관세포로 이중분화 잠재성이 있는 배상체를 유도하였다. 부유배양을 통해 조혈계통으로 분화 가능한 고효율의 혈액모세포 분화와 부착배양을 통해 기능성 혈관세포로 분화하였다. 그 결과, 인간 배아줄기세포 유래의 혈액모세포와 혈관세포를 시간을 단축하면서 고효율의 세포를 생산하였다.
본 연구의 결과는 조혈, 혈관 신생 및 혈관 생성에 관한 임상에 사용 가능한 세포 치료제의 공급뿐만 아니라 줄기세포 연구에 매우 유용 할 것이다.
Keyword : 세포치료, 분화, 혈관세포, 혈액모세포, 조혈과정, 인간배아줄기세포

 
목차
Chapter 1 General background 1
1.1. Human pluripotent stem cell 2
1.2. Hematopoiesis 3
1.3. Heamngioblast 4
1.4. Endothelial cell 5
1.5. Cell therapy 6

Chapter 2 Derivation of hemoangiogenic-like cells from hESC through DPBS dissociation 8
2.1. Introduction 10
2.2. Materials and methods 12
2.2.1. Human embryonic stem cell culture and dissociation 12
2.2.2. Derivation of hemangioblasts from single cell dissociated hESCs 13
2.2.3. Flow cytometric analysis 15
2.2.4. Immunocytocehmistry analysis 15
2.2.5. Wright-Giemsa staining 16
2.2.6. Statistical analysis 16
2.3. Results 17
2.3.1. Enzyme mediated dissociation and its impact on hemangioblast differentiation 17
2.3.2. Comparing the effectiveness of cell dissociation reagents on hESCs 19
2.3.3. Characterization of hemangioblasts derived from single cell dissociated H9-hESCs without enzymatic treatment 26
2.4. Discussions 33

Chapter 3. Simple generation of endothelial cells from hemoangiogenic-like cells without purification 35
3.1. Introduction 37
3.2. Materials and methods 40
3.2.1. Human embryonic stem cell culture 40
3.2.2. Embryoid body induction and endothelial cell derivation 40
3.2.3. RNA extraction and RT-PCR analysis 43
3.2.4. Immunocytochemistry 45
3.2.5. Flow cytometry analysis 45
3.2.6. Matrigel assay 46
3.2.7. Ac-LDL uptake 46
3.2.8. Ischemic hindlimb model and cell transplantation 46
3.2.9. Laser Doppler analysis 47
3.2.10. Micro computed tomography 47
3.2.11. Histological and immunohistochemistry analysis 48
3.2.12. Fluorescence in situ hybridization (FISH) analysis 49
3.2.13. Statistical analysis 49
3.3. Results 51
3.3.1. Simple derivation of endothelial cells without purification 51
3.3.2. Characterization of the hESC-ECs 51
3.3.3. Enhanced vascularization by in vivo transplantation of hESC-ECs in ischemic mice 60
3.3.4. Restored muscle and tissue structure by hESC-EC transplantation 66
3.4. Discussion 70

References 73
Abstract (in Korean) 80

주제어
Cell therapy, Differentiation, Endothelial cell, Hemangioblast, Hematopoiesis, Human embryonic stem cell